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醫(yī)療器械體外細(xì)胞毒性檢測詳解
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什么是體外細(xì)胞毒性試驗？
體外細(xì)胞毒性試驗是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測醫(yī)療器械及生物材料接觸機(jī)體組織后所發(fā)生的細(xì)胞溶解、抑制細(xì)胞生長和其他毒性作用的體外試驗。體外細(xì)胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物學(xué)評價體系中最重要的檢測指標(biāo)之一，幾乎也是醫(yī)療器械及生物材料臨床應(yīng)用前的必選項目。
哪些產(chǎn)品需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗？
與人體接觸或植入體內(nèi)的醫(yī)療器械都需要進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗。與人體接觸的部位包括：
1）表面：皮膚，粘膜，損傷表面。
2）外部接入：組織/骨/牙，循環(huán)血液。
3）體內(nèi)植入：組織/骨，血液。
體外細(xì)胞毒性試驗的目的和意義
目的：評級醫(yī)療器械和生物材料致細(xì)胞毒性反應(yīng)的潛在性，并預(yù)測最終生物體應(yīng)用時的組織細(xì)胞反應(yīng)。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可檢測供試品接觸細(xì)胞后細(xì)胞發(fā)生生長抑制、功能改變、細(xì)胞溶解、死亡或其他毒性反應(yīng)。
意義：可在短時間內(nèi)較經(jīng)濟(jì)、簡便地篩選出批量供試品的細(xì)胞毒性，它為動物試驗的進(jìn)行與否提供了先決條件，對新型醫(yī)療器械及生物材料的研制和應(yīng)用提供了重要保證。
體外細(xì)胞毒性試驗依據(jù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)
ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of Medical Devices--Part 5:Tests for in vitro Cytotoxicity
GB/T16886.5-2007醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗，GB/T16886是由ISO 10993轉(zhuǎn)化過來的標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 16175-2008醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價試驗方法
GB/T 14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物試驗方法
YY/T0127.9-2009口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評價第2單元試驗方法細(xì)胞毒性試驗：瓊脂擴(kuò)散法及濾膜擴(kuò)散法
細(xì)胞系和培養(yǎng)基的選擇
優(yōu)先采用已建立的細(xì)胞系并從認(rèn)可的貯源獲取。試驗只能使用無支原體污染細(xì)胞，使用前應(yīng)該檢測原代培養(yǎng)細(xì)胞是否存在支原體。推薦使用小鼠成纖維細(xì)胞或人上皮細(xì)胞，如果能證明試驗的重現(xiàn)性和精確性，也可選擇其他細(xì)胞系。使用凍存細(xì)胞時，如果有二甲亞砜或甘油等細(xì)胞保護(hù)劑，應(yīng)該除去保護(hù)劑，使用前至少傳代培養(yǎng)一次。傳代培養(yǎng)細(xì)胞時，采用適合細(xì)胞系的酶分散法或機(jī)械分散法移出和重懸細(xì)胞。
培養(yǎng)基應(yīng)無菌，含血清或無血清培養(yǎng)基應(yīng)該符合選定細(xì)胞系的生長要求，培養(yǎng)基中可以含有對試驗無不良作用的抗生素，pH值應(yīng)該保持在7.2~7.4之間，且培養(yǎng)基的貯存條件應(yīng)該經(jīng)過驗證才能在此條件下進(jìn)行保存。
體外細(xì)胞毒性試驗原則
體外細(xì)胞試驗方法較多，且各有其特點，各試驗方法之間很難達(dá)到完全一致，因此在選擇試驗方法時，需根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況”的原則，盡可能合理地選擇供試品與細(xì)胞的接觸方式和檢測生物終點評價方法。
體外細(xì)胞毒性試驗方法
體外細(xì)胞毒性試驗具有通用性，可以適用于各種醫(yī)療器械和生物材料的評價，GB/T16886.5標(biāo)準(zhǔn)不是規(guī)定一個單一的試驗方法，而是規(guī)定一個試驗方案，需要在一系列試驗步驟中判斷，以選出最合適的試驗，試驗主要分三類：浸提液試驗，直接接觸試驗和間接接觸試驗（瓊脂擴(kuò)散試驗和濾膜擴(kuò)散試驗）。
由于醫(yī)療器械產(chǎn)品和材料的多樣性，植入機(jī)體環(huán)境中的變異性，與機(jī)體相互作用的復(fù)雜性等因素，選擇哪種方法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價，不同的試驗人員會有不同的選擇。當(dāng)一個評價項目具有多個試驗方法時，應(yīng)考慮試驗的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現(xiàn)性、試驗材料的適用性及局限性等因素進(jìn)行選擇。例如浸提液法適合檢測溶出物的毒性；直接接觸法對材料的細(xì)胞毒性敏感性最高，可檢測出材料微弱的細(xì)胞毒性，間接接觸法中的瓊脂擴(kuò)散試驗適合于毒性大的大批量材料篩選，濾膜擴(kuò)散法適合于小分子量毒性材料的評價。以上各種方法因原理不同，各有特點，應(yīng)根據(jù)試驗材料本身理化性質(zhì)、毒性作用強(qiáng)弱及其用途，正確地選擇試驗方法。
浸提液試驗-MTT法，XTT法和WST-8法比較
MTT（二苯基四氮唑）法，又稱MTT比色法，檢測原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法有靈敏度高、較經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點。
XTT（二甲氧唑黃）是類似MTT的化合物，XTT法檢測原理與MTT法相同。在電子耦合試劑存在的情況下，活細(xì)胞線粒體中存在與輔酶Ⅱ相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的XTT還原成水溶性的橘黃色的甲瓚，生成的甲瓚能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，不形成顆粒，可直接用酶標(biāo)儀測定吸光值。
WST-8（四唑單鈉鹽）屬于MTT的升級產(chǎn)品，檢測原理是在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲瓚產(chǎn)物。產(chǎn)物顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，但是價格比MTT法略高。
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